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懸浮細胞的瞬時轉(zhuǎn)染操作

 更新時間:2023-12-25 點擊量:376
  知道懸浮細胞的瞬時轉(zhuǎn)染操作有什么嗎?讓我們一起來看看吧!
  一、細胞轉(zhuǎn)染前的準備
  1、細胞:
  貼壁生長細胞:一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,必須應(yīng)用胰酶處理成單細胞懸液,重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,轉(zhuǎn)染當日的細胞密度以70-90%(貼壁細胞),最好在轉(zhuǎn)染前2-4 h換一次新鮮培養(yǎng)液。
  懸浮細胞:轉(zhuǎn)染前12-16 h進行懸浮細胞傳代,傳代后適宜的細胞密度為20-40×104/mL。臺盼藍染色進行活細胞計數(shù)保持活細胞比在95%以上。
  提前將293F細胞的密度調(diào)整至合適的密度后(2×106-4×106細胞/ml)于37℃搖床培養(yǎng)2-4 h后進行轉(zhuǎn)染。注意,參與轉(zhuǎn)染的細胞必須是培養(yǎng)三代或以上的穩(wěn)定細胞株。
  2、DNA:
  使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒,于生物安全柜/超凈臺用0.22μm濾頭過濾除菌。
  3、稀釋液:
  于生物安全柜/超凈臺用0.22μm濾頭過濾除菌。
  4、轉(zhuǎn)染試劑:
  轉(zhuǎn)染試劑如PEI溶液長期儲存于-20℃,不可反復(fù)凍融,溶液在4℃放置不超過一周。
  二、操作步驟(懸浮細胞)
  1、取一支已滅菌的Ep管,加入一定量的DNA,以相應(yīng)體積的300 mM NaCl稀釋,用槍頭混勻后靜置5 min;
  另取一支已滅菌的Ep管,加入相應(yīng)體積的300 mM NaCl稀釋對應(yīng)體積的PEI溶液用槍頭混勻后靜置5 min(稀釋液與DNA、PEI的總體積應(yīng)為轉(zhuǎn)染體積的5%)。
  將質(zhì)粒和PEI溶液混合,槍頭混勻后靜置一段時間,使DNA與PEI形成穩(wěn)定的聚合物。
  2、從搖床中取出293F細胞。用1 mL移液槍滴緩慢滴加轉(zhuǎn)染混合液,邊加邊搖晃搖瓶使轉(zhuǎn)染更加充分。
  3、轉(zhuǎn)染后將懸浮細胞置于搖床中培養(yǎng),條件為37℃、8%CO2、110 rpm。每隔24 h進行細胞計數(shù)并用臺盼藍染色液觀察細胞的存活率。
  更多有關(guān)懸浮細胞的瞬時轉(zhuǎn)染操作,請聯(lián)系北京百奧創(chuàng)新科技有限公司。
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